副溶血弧菌转录因子AphA调控生物膜基因的初步研究

【摘要】副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus,简称VP)是一种嗜盐性革兰氏阴性致病菌,人们若食用了被VP菌污染的生的或未煮熟的食物后可能会引起发热、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等急性胃肠炎症状。VP菌可以游离于海水环境,也可以在固相表面形成生物膜,生物膜是其适应不利环境而采取的主要生存策略,生物膜形成受环二鸟苷酸(Cyclicdiguanylate,c-di-GMP)信号通路和密度感应(Quorumsensing,QS)系统的调节。VP菌在小核糖核酸RNA(Quorum-regulatedsmallRNAs,QrrsRNAs)的参与下,调节全局调控子OpaR和AphA的表达。VP菌在高密度时,OpaR起核心调节作用；在低密度时,AphA起核心调节作用,通过表型结果显示它能促进生物膜形成和毒力因子的表达,但是其分子机制还未被阐明。目的：综合运用表型与分子生化实验研究AphA蛋白对VP菌生物膜形成的调节机制。方法：首先利用菌落褶皱与结晶紫染色实验比较野生株(WT)和aphA突变株(△AaphA)的表型差异；进而再利用色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)的方法检测WT与△aphA各自中c-di-GMP分子的含量。利用生物学软件设计AphA蛋白位于胞浆区的N-末端DNA结合域的上下游引物,扩增AphA蛋白N-末端DNA结合域,然后酶切连接到pET-28a-c(+)质粒,转化到大肠杆菌BL21(λDE3)中,通过鉴定筛选出AphA的蛋白表达株,所得菌株经IPTG诱导后,再经Ni-NTA柱纯化,最后透析浓缩得到带His标签的AphA蛋白。利用生物信息学的方法,对AphA蛋白与DNA的结合基序进行预测,并筛选感兴趣的基因,通过凝胶迁移阻滞实验(Electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)验证His-AphA蛋白对生物膜靶基因启动子区是否具有直接的相互作用。利用生物学软件设计9个生物膜基因(包括胞外多糖和c-di-GMP合成的基因)的启动子区上下游引物,扩增这些毒力基因启动子区,然后酶切连接到pHRP309质粒上,转化到大肠杆菌JM109中,鉴定、测序并筛选出阳性的单克隆,提取重组质粒并转化到副溶血弧菌野生株(WT)和aphA突变株(△aphA)中,通过测定野生株(WT)和突变株(△aphA)中β-半乳糖苷酶活性的差异,研究AphA对靶基因的调控关系。提取WT和△aphA的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法研究AphA对scrABC和scrG的调控关系；结果：通过表型实验结果显示AphA能促进VP菌生物膜的形成,利用色谱串联质谱的方法检测WT与△aphA各自中c-di-GMP分子的含量,结果显示AphA匕促进c-di-GMP的合成；利用大肠杆菌BL21(λSE3)表达系统成功表达出了有活性的His-AphA蛋白。EMSA实验结果表明：His-AphA蛋白能特异性地结合到VP0376.VP0485和VP1469的启动子区,VPA1513(scrABC).VP1377(scrG)、VP0117.VPA0198.VP1403和VP1476的启动子区无直接结合作用；LacZ艮告基因融合实验结果显示AphA能激活VP1469和VP0485的转录表达,而对VPA1513.VP1377和VP0376具有转录抑制作用；利用实时定量RT-PCR的方法研究表明AphA抑制scrABC和scrG的转录表达。结论：所表达的His-AphA蛋白可用于后续的转录调控机制研究；AphA通过直接激活VP0485.VP1469的转录表达,直接抑制VP0376的转录表达,间接抑制scrABC.scrG的转录,从而促进VP菌胞外多糖和c-di-GMP的合成,进而促进其生物膜的形成,使VP菌具有高感染性。
【作者】黄倩；
【导师】黎晓敏；周冬生；
【作者基本信息】西南大学，基础兽医学，2014，硕士
【关键词】副溶血弧菌；AphA；DNA结合活性；转录调控；

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